用户文章 New Phytol-苹果树腐烂病菌小RNA对毒力基因的适应性调控

论文标题：Adaptive regulation of virulence genes by microRNA-like RNAs in Valsa mali刊登日期：2020年03月发表杂志：New Phytologist影响因子：7.299研究机构：西北农林科技大学联川提供：转录组测序，miRNA测序，降解组测序

近日，联川生物合作客户西北农林科技大学黄丽丽教授研究团队在New Phytologist上在线发表了题为“Adaptive regulation of virulence genes by microRNA-like RNAs in Valsa mali ”的研究论文。该研究揭示了苹果树腐烂病菌microRNA-like RNA (milRNA)适应性调控病菌致病性的分子机制。植保学院博士研究生许铭为论文第一作者，黄丽丽教授和冯浩教授为该论文的共同通讯作者。

microRNA（miRNA）是参与动植物RNA干扰（RNAi）的一类长度为18-25 nt的非编码RNA分子，在转录后水平通过抑制靶标基因的表达参与动植物生长、发育、生物和非生物胁迫应答等多个生理过程。近年来，真菌milRNA开始被挖掘和鉴定，但其生物学功能和作用机理尚不明确。

该研究在前期发现苹果树腐烂病菌（Valsa mali）存在相关通路的关键蛋白并明确其参与病菌致病过程的基础上，通过高通量测序和生信分析鉴定了该病原菌的milRNA及其靶标基因，结合转录组测序进一步揭示了milRNA与靶标基因的调控关系，并鉴定出多个参与病菌致病过程的miRNA，并发现Vm-milR16在菌丝体中表达量较高，而在病菌的侵染阶段表达量显著下调，且过表达Vm-milR16使致病菌致病力大幅下降。

进一步研究发现Vm-milR16在菌丝体中特异性地抑制了病菌致病相关的蔗糖非发酵激酶基因（VmSNF1）、4，5-多巴雌二醇双加氧酶基因（VmDODA）和假想蛋白基因（VmHy1）的表达。而在病菌侵染过程中通过下调Vm-milR16的表达解除上述致病相关基因的抑制，导致这些基因在病菌侵染过程中上调表达从而促进病菌的侵染。

该研究揭示了苹果树腐烂病菌milRNA适应性调控病菌致病的新机制，丰富了对植物病原真菌milRNA功能及其调控机理的认知。

背景介绍

RNA干扰（RNAi）是真核生物中通过mRNA剪切，转录或翻译抑制来抑制基因表达的保守机制。RNAi途径中存在三种主要的保守蛋白，Dicer或Dicer-like（DCL）蛋白将单链RNA前体剪切为miRNA或将双链RNA剪切为小干扰RNA（siRNA）。RNA依赖性RNA聚合酶（RdRPs）参与了沉默反应的放大，小RNA（sRNA）装载到Argonaute（AGO）蛋白中，通过互补序列配对来诱导mRNA降解，组蛋白或DNA甲基化修饰以及翻译抑制。RNAi最初被认为是构成抵御入侵核酸（如转座子，转基因和病毒）的防御机制，而最新研究发现RNAi也是影响许多真核生物生长，发育，繁殖以及生物应答或非生物胁迫的重要调控机制。

苹果树腐烂病是由苹果树腐烂病菌引起的严重病害之一，严重影响苹果的产量。病原体主要通过树皮上的伤口或自然小孔侵入苹果树，并引起严重的组织浸渍和坏死。基因组和转录组测序以及功能基因组学研究揭示了许多毒力因子，例如细胞壁降解酶，分泌效应物，G蛋白，绒状蛋白和PacC转录因子都与毒力有关。更重要的是苹果树腐烂病菌中RNAi通路中的Dicer-like和AGO似乎参与了应激反应和致毒性，这表明转录后调控可能参与了苹果树腐烂病的发病机理。在这项研究中，高通量测序以及分子和组织学分析表明，苹果树腐烂病菌的毒力受Vm-milRNA介导的转录后调控。Vm-milRNA和相应靶基因的功能分析表明milRNA可以适应性调节毒力基因以促进病原体侵染。

实验材料

为了研究Vm-milRNA在苹果树腐烂病菌-苹果树皮互作中的调控机制，采集无菌培养的3日龄苹果树腐烂病菌菌丝体（MVm）和接种了苹果树腐烂病菌 3天的健康/侵染交界处的树皮组织（IVm）。将苹果树腐烂病菌菌丝块（d = 5 mm）接种到苹果的离体小枝上。每种处理各三个生物学重复。

研究结论

苹果树腐烂病菌中milRNA的鉴定和表达丰度

为了确定milRNA是否参与苹果树腐烂病菌的毒力调节，对MVm及IVm分别进行miRNA测序并从苹果树腐烂病菌中鉴定了57个milRNA。在MVm和IVm中分别鉴定出56个和15个Vm-milRNA。

有趣的是，在MVm或IVm中分别有42个和1个特异性表达的Vm-milRNA。在MVm和IVm中均表达了14种Vm-milRNA，图1a表明一些Vm-milRNA可能参与毒力的调节。

图1

鉴定与苹果树腐烂病菌致病性有关的候选靶基因

接下来作者构建了两个降解组测序文库（TMVm和TIVm）以鉴定Vm-milRNA的靶基因。总共检测到45种Vm-milRNA的356个潜在靶标。GO分析表明，候选靶基因富集于细胞过程，代谢过程，单组织过程，催化活性，结合，细胞和膜。KEGG分析表明Vm-milRNA靶基因似乎也富集于碳水化合物代谢，翻译，转运和分解代谢。分析Vm-milRNA及其候选靶基因的表达模式发现，大多数Vm-milRNA与它们的靶基因的表达呈负相关。

为了进一步确定milRNA靶基因是否与苹果树腐烂病菌的毒力有关，将靶基因与病原体-宿主相互作用数据库（PHI-base）进行比对。预测结果表明，Vm-milRNA的许多靶基因属于致病性或致死性基因（表1）。因此，作者推测Vm-milRNAs可能通过调节毒力基因的表达影响苹果树腐烂病菌的致病性。

表1

Vm-milRNA16在病原菌致病性中发挥关键作用

通过Vm-milRNA的过表达筛选其在致病过程中的功能。结果表明，Vm-milR2、3、8、9、13、14、10、16、17、19和48的过表达可以显著降低苹果树腐烂病菌的毒力。其中Vm-milR16的过表达降低毒力的作用最明显。此外，pri-Vm-milR16缺失突变体在体外正常生长，但毒力略有降低。Vm-milR16含有一个64 bp的假定前体，可形成典型的发夹结构（图2a）。

Vm-milRNA16可调控3个靶基因的表达

降解组测序结果表明，Vm-milR16参与了几个转录本的剪切。其中，VM1G_09934被鉴定为候选毒力基因。在侵染期间，另外两个转录本VM1G_10693和VM1G_11912似乎被上调了。在体外菌丝体中可以检测到VM1G_09934，VM1G_10693和VM1G_11912的剪切信号，但在苹果树腐烂病菌侵染期间未检测到剪切信号。进一步的基因注释结果显示，VM1G_09934编码的非特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶与酿酒酵母的蔗糖非发酵酶1（SNF1）和几种植物病原真菌具有高度相似性。因此，将VM1G_09934基因称为VmSNF1。VM1G_10693基因编码4、5-DOPA双加氧酶外二醇，将其称为VmDODA。VM1G_11912基因编码一种假想蛋白质，称为VmHy1。

qRT-PCR验证结果表明，在苹果树腐烂病菌侵染期间Vm-milR16在6、12、24、48、72 hpi时显著下调（图2b），Pri-Vm-milR16也显著下调。在侵染期间，所有候选靶基因的转录水平均有增强（图2c-e）。因此，Vm-milR16与候选靶基因的负相关表达可能表明VmSNF1，VmDODA和VmHy1确实是Vm-milR16的靶基因。

图2

Vm-milRNA16以序列特异性方式调节靶基因表达

为了证实Vm-milR16的调控机制，设计了Vm-milR16突变的过表达转化株（Mut-R16）（图3a）。两个Vm-milR16过表达转化株（OE-2和OE-8）分别显示出8倍和6倍的转录增强作用。Mut-R16过表达转化株未显示Vm-milR16的表达水平提高（图3b）。Vm-milR16的过表达导致营养生长略有下降（图3c，d）。根据病害大小和真菌生物量测定，Vm-milR16的过表达显著降低了苹果树腐烂病菌的毒力（图3e-g）。但是当Mut-R16过表达时，没有观察到显著变化（图3e-g）。这些结果证实了作者的假设，即成熟的Vm-milR16在苹果树腐烂病菌毒力中起重要作用。

此外，在体外和侵染期间，作者对野生型，Vm-milR16过表达转化株和Mut-R16过表达转化株中的VmSNF1，VmDODA和VmHy1基因的转录水平进行了定量。在体外（图3h）和植物体中（图3i），Vm-milR16过表达转化株中VmSNF1，VmDODA和VmHy1的表达量均被显著抑制，而在Mut-R16过表达转化株则中没有被抑制。这些结果表明，Vm-milRNA16以序列特异性的方式调节靶基因的表达。

VmSNF1，VmDODA，及VmHy1是病原菌完整毒力所必须的

Vm-milR16过表达转化株毒力降低及其靶基因表达降低表明Vm-milR16的某些靶基因可能与苹果树腐烂病菌的毒力有关。同源重组构建了VmSNF1，VmDODA，及VmHy1缺失突变体，毒力鉴定结果表明VmSNF1，VmDODA，及VmHy1是病原菌产生完整毒力必须的3个基因。

图3

组织学分析评估野生型、Vm-milR16过表达转化株、ΔVmKu80和靶基因（VmSNF1，VmDODA和VmHy1）缺失突变体的定殖能力。野生型和ΔVmKu80菌株占据整个皮质，并导致严重的组织降解。相比之下，Vm-milR16过表达转化株只有很少的菌丝定殖在外皮层，仅引起轻微的组织降解。同时，VmSNF1，VmDODA和VmHy1缺失突变体的定殖能力降低并出现轻微的组织降解（图4）。因此，在苹果树腐烂病菌侵染过程中Vm-milR16的下调导致毒力基因的上调，从而促进侵染和定殖。

图4

Vm-milR16的靶基因通过适应宿主的氧化应激反应并诱导果胶酶基因的表达来调控毒力

植物可以通过产生活性氧来抑制病原体的侵染和定殖。在这项研究中，Vm-milR16过表达转化株和靶基因（VmSNF1，VmDODA和VmHy1）缺失突变体对氧化应激的敏感性增强（图5a，b）。在接种Vm-milR16过表达转化株和靶基因缺失突变体的苹果树叶片中观察到ROS积累增加（图5 c，d）。该结果表明野生型（和ΔVmKu80）可以有效清除宿主产生的ROS。然而，Vm-milR16的过表达或其靶基因VmSNF1，VmDODA或VmHy1的缺失会对苹果树腐烂病菌的ROS清除能力产生负面影响。因此，VmSNF1，VmDODA和VmHy1的表达增加有助于在侵染过程中增强氧化应激反应和苹果树腐烂病菌的适应性。

图5

根据组织学观察结果，VmSNF1缺失突变体显示出较强的组织降解能力。因此，作者推测VmSNF1的缺失可能影响苹果树腐烂病菌果胶酶的表达。因此，在接种了24小时的ΔVmKu80或VmSNF1缺失突变体的组织中测试了8个果胶酶基因的表达。在VmSNF1缺失突变体中，8个果胶酶基因均显著下调（图6a）。同时，还测量了接种ΔVmKu80或VmSNF1缺失突变体的苹果树树皮组织中的果胶酶活性。VmSNF1缺失突变体中果胶酶活性显著降低（图6b）。重要的是，与野生型相比，Vm-milR16突变体的果胶酶活性也显着降低（图6c）。结果表明，VmSNF1通过调节果胶酶基因的表达参与侵染过程。

图6

基于研究结果，作者推测苹果树腐烂病菌中的许多milRNA均被特异性表达或上调以抑制毒性基因的表达。这种抑制作用在病原体与宿主相互作用过程中得到缓解，以提高毒力基因的表达。结果表明Vm-milRNA可以适应性调节苹果树腐烂病菌中的毒力基因（图7）。

图7

讨论

在植物和病原体的长期竞争中，植物和病原体分别产生了抗性和致病性机制。植物免疫反应包括一系列生理和生化变化，例如离子通量变化，诱导抗性基因表达，ROS爆发和抗菌化合物的产生。同时，植物病原体需要具备防御抑制功能以减少伤害，并在病原体与宿主相互作用中生存。在基因组和转录组水平上的大量研究揭示了病原真菌对宿主的适应性。植物病原真菌已经进化出大量防御机制，例如可降解细胞壁的酶，毒素和蛋白质效应子，以破坏植物组织并干扰宿主免疫力。为了适应宿主环境，植物病原真菌在不同阶段可精确调节基因表达以促进侵染进程。

普遍认为植物中的miRNA是植物应对不利环境条件（包括植物与病原体的相互作用）做出反应的必要组成部分。真菌milRNA与动植物miRNA具有共同的特征。例如，小麦条锈菌利用Pst-milRNA1抑制致病相关的2个基因来促进侵染。本研究中，作者展示了另一种植物病原真菌——苹果树腐烂病菌，可以适应性地调节其内源性毒力基因来促进侵染。将序列数据比对到miRBase 22.0，未发现同源miRNA。里氏木霉和尖镰孢菌也发现了类似的结果，表明真菌milRNA的物种特异性很高。

尽管在植物致病真菌中鉴定到了许多milRNA，但迄今为止，鉴定milRNA靶基因的方法限制了真菌中milRNA的功能探索。植物可以将sRNA转运到真菌中并通过mRNA剪切沉默真菌靶基因，这表明sRNA介导的mRNA剪切存在于真菌中。这种机制可以产生带有5'磷酸的mRNA末端，根据降解组测序的原理，这些末端可用于鉴定milRNA靶基因。因此，降解组测序也能用于鉴定Vm-milRNA的靶基因。在动植物中，miRNA的剪切位点主要位于第10和11位核苷酸之间（milRNA的5'到3'）。基于此，本研究使用第10与第11个核苷酸之间的剪切位点来确定候选靶基因的剪切位点。真菌中milRNA的生成和作用机制似乎非常复杂和多样。之前的研究表明，真菌转录物不仅在小RNA的第10和11位核苷酸的相对位置发生剪切，而且还可以在其他位置发生剪切。因此，本研究中确定的靶基因只是调控网络的一部分，具有其他剪切位点和不同机制的靶基因仍需要进一步探索。

Vm-milR16通过抑制VmSNF1，VmDODA，VmHy1的体外表达来负调控果胶酶和氧化应激反应基因的表达。在侵染过程中，Vm-milR16的下调降低了这种抑制，这有助于毒力基因的表达并增强了苹果树腐烂病菌的适应性。VmSNF1同源序列已被鉴定为植物病原真菌中的必需毒力基因，因其具有影响细胞壁降解酶表达的功能。另外果胶酶也是苹果树腐烂病菌的重要致病因素。VmSNF1缺失突变体极大的降低了果胶酶基因的表达和对氧化应激的超敏反应。这就可以解释VmSNF1缺失突变体毒力显著降低的原因。VmDODA编码4、5-DOPA双加氧酶外二醇（DODA），它是甜菜碱相关色素生物合成中的关键酶。尽管该基因最初是在真菌中鉴定的，但DODA在植物致病真菌中的功能仍然不清楚。本研究中，VmDODA缺失突变体在体外和植物体内均表现为毒力降低和对氧化应激的敏感性增强。在植物中，甜菜碱具有很强的ROS清除活性。真菌可以通过与植物进化趋同的相关途径产生与甜菜碱相关的色素。因此，VmDODA可以在苹果树腐烂病菌侵染期间适应性地参与ROS清除。

本研究发现苹果树腐烂病菌在转录后水平上通过milRNA适应性地调节毒力基因，以促进侵染。研究结果加深了对真菌病原体，尤其是枝干病害病原体的致病机理的认识。

相关阅读